用途 :本试剂盒采用实时荧光RT-PCR方法检测偶蹄动物水泡皮、水泡液及OP液中的口蹄疫病毒 (FMDV)的RNA。适用于FMDV的诊断、检测和流行病学调查。 原理 利用离心柱内硅基质膜提取样品总RNA,在高效反转录酶的作用下,以RNA为模板,以 引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在热启动Taq 酶的作用下,经高温变性、中温退火 及延伸的循环,使特异DNA片段的拷贝数放大一倍,经荧光素标记的探针与扩增的DNA杂交,利 用Taq 聚合酶的5'→3'外切活性,使荧光探针的报告基团与淬灭基团分离,发出特异性荧光信号,利 用荧光PCR仪检测特异性荧光信号,根据样品Ct值的大小及扩增曲线的形成情况判定结果。
试剂盒组成 :详见说明书
保存期 :本产品有效期为12个月。
需要自备的物品
1.仪器:分析天平、离心机、荧光PCR扩增仪、组织研磨器、-20 ℃冰箱、可调移液器(2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL)。
2.耗材:荧光PCR专用反应管、眼科剪、眼科镊、生理盐水、1.5 mL经焦碳酸二乙酯(DEPC)水 处理的灭菌离心管、吸头(10 µL、200 µL、1000 µL)、灭菌双蒸水。
注意事项
1.所有接触病料的物品均应合理处置,以免污染实验室。
2.PCR 整个试验分配液区、模板提取区、扩增区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区。严 禁器材和试剂倒流。
3.所有试剂应在规定的温度储存。-20℃保存的各试剂管使用前应完全融化,8000 rpm离心15 s, 使液体全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取,使用后立 即放回-20 ℃。
4.在RNA提取过程中,避免RNA酶污染,尽量缩短操作时间。
5.注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂,试剂盒之间的成分不要混用。
6.严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。
7.反应体系应在特定配液区或者超净工作台中配制,整个实验过程严格控制污染。
8.反复冻融试剂将减低检测灵敏度,本试剂盒应在3次内用完,请严格按试剂盒说明书操作。
样品制备
1 样品采集:病死或扑杀动物,取水泡皮及水泡液;待检活动物,取OP液2~3 mL。2~8 ℃保存, 送实验室检测。(要求送检病料新鲜,严禁反复冻融病料。)
2 样品处理:每份样品分别处理。
2.1 组织样品处理:称取水泡皮0.05 g于研磨器中研磨,加入生理盐水继续研磨,待匀浆后转至1.5 mL灭菌离心管中,8000 rpm离心2 min,取上清液100 µL于1.5 mL灭菌离心管中。
2.2 液体样品处理:取OP液或水泡液样品100 µL,置1.5 mL灭菌离心管中。
2.3 阳性对照处理:取阳性对照100 µL,置1.5 mL灭菌离心管中。 2.4 阴性对照处理:取阴性对照100 µL,置1.5 mL灭菌离心管中。
操作步骤 详见说明书